近期，成都中医药大学西南特色中药资源国家重点实验室/中医药创新研究院黎胜红研究团队在国际化学顶级期刊Angewandte Chemie - International Edition（Nature Index，中科院JCR一区）上发表了题为 “A cryptic plant terpene cyclase producing unconventional 18- and 14-membered macrocyclic C25 and C20 terpenoids with immunosuppressive activity”的研究论文。

 萜类化合物是植物中种类最多、化学结构变化最为丰富的一类天然产物，在植物生长发育、适应环境胁迫等方面发挥着重要作用，并具有重要药用和经济价值。二倍半萜是一类稀有的萜类天然产物，结构新颖复杂、生物活性广泛，大多存在于海洋生物中，目前对于二倍半萜在植物中的分布规律、生物功能与生物合成知之甚少。黎胜红研究团队多年来致力于特色药用植物中萜类天然产物的化学多样性、生物功能和生物合成研究。近期该团队从唇形科药用植物米团花中鉴定了一个双功能的二倍半萜/二萜合酶，能够催化生成6个大环二倍半萜和2个大环二萜产物，其中5个为新化合物，包括2个首次发现的具有18元环的二倍半萜，也是迄今为止发现的具有最大碳环结构的萜类天然产物。通过分子对接结合定点突变获得了2个二倍半萜产量显著提高的突变酶，并发现大环二倍半萜的免疫抑制活性。

 该团队从米团花腺毛转录组中发现了一个预测定位于叶绿体的TPS-a家族萜类合酶LcTPS2，运用工程大肠杆菌和本氏烟草异源表达体系，发现LcTPS2催化GFDP和GGDP分别形成6个二倍半萜和2个二萜产物。通过分离纯化、现代波谱技术结合DP4+计算，鉴定化合物1和2为具有18元碳环的二倍半萜，化合物3-6为14元碳环的二倍半萜，化合物7和8为14-元碳环的西松烷二萜。二萜化合物7和8在米团花的叶中可被检测到，而二倍半萜化合物1-6在该植物中均未检测到，推测可能被转化成进一步官能团化的产物。qRT-PCR分析发现，LcTPS2主要在米团花叶中表达，茉莉酸甲酯可诱导LcTPS2的表达量增高，且与LcGFDPS和LcGGDPS 3/4（二倍半萜和二萜直链前体生物合成的关键酶）的表达呈正相关，同时二萜化合物的含量也升高。体外酶促反应分析发现，LcTPS2同时具备萜类合酶和异戊烯基转移酶的功能，能够催化合成大环萜类和异戊烯基吲哚类化合物。系统发育分析表明，LcTPS2可能起源于倍半萜合酶的复制和新功能化，但其倍半萜合酶活性完全丧失，此外，LcTPS2区别于十字花科植物中的二倍半萜合酶，具有独立的起源和进化。              

 通过分子对接，发现了17个可能与底物相互作用（直接或间接）或位于柔性位点/活性腔底部的氨基酸残基。结合定点突变实验，构建了28个突变酶，发现上述17个氨基酸残基对酶的催化效率和/或产物特异性至关重要。其中，2个突变酶F516A和F516G的二倍半萜化合物产量显著提高（分别为野生型的3.3倍和2.5倍），同时二萜化合物产量减少；而L298位点突变后，二倍半萜产量严重减少，二萜产量则影响较小，推测减小F516残基大小（突变为A/G）可能导致活性腔变大，从而偏好C25底物，而增加L298残基大小（突变为W/Y/F）则活性腔变小，从而偏好C20底物。

 活性筛选发现，二倍半萜化合物1、3、5和6对PHA联合PMA诱导的Jurkat细胞分泌IL-2有明显抑制作用，化合物1和3对CD3/CD28单抗诱导小鼠T细胞分泌IFN-γ也有明显抑制作用。与此同时，在浓度为40 μM时，所有化合物对小鼠脾细胞均无明显细胞毒性。Western blot分析表明，化合物1和3可能通过抑制ERK和JNK的磷酸化影响MAPK信号通路，从而发挥免疫抑制活性。该研究为大环二倍半萜类活性天然产物生物合成工具酶的开发应用奠定了重要基础，并为揭示植物二倍半萜的化学多样性、分布规律、生物功能和生物合成等提供了有价值的参考。

 博士研究生陈月桂、李德森和凌伊硕士为本文共同第一作者，黎胜红教授和刘燕教授为本文通讯作者。该工作得到国家自然科学基金重点项目（21937006）、国家杰出青年基金项目（31525005）和云南省生物医药重大科技专项（2019ZF011-2）等资助。

文章链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202110842

                                        （文、图/中医药创新研究院 李丹 编辑/霍文巍）